Lección 1: Introducción al HPLC

1. Introducción
2. ¿Qué es la cromatografía liquida?
3. ¿Qué es el HPLC?
4. Los componentes del HPLC
4.1 bomba
4.3 Inyector
4.3 columna
4.4 Detector
4.5 Grabadora
4.6 desgasificador
4.7 Horno de columna
5. Otros tipos de Cromatografías

 

(Petróleo Éter)

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          Figure 1. Tswett’s LC analysis.

1. Introducción

Esta página web es para la introducción de información básica sobre cromatografía líquida y los productos Shodex ™.  La explicación que se utiliza aquí es simple y fácil de entender,  por lo tanto las palabras utilizadas no pueden ser apropiadas para referencias científicas.

Noticias:

  1. Naranja = Orange
  2. Amarillo = Yellow
  3. Amarillento = Yellowish Green
  4. Verde Azulado = Bluish Green

2. ¿Qué es la cromatografía de líquidos?
La historia de la cromatografía líquida (CL) se inició a principios del siglo XX. En 1906, un botánico ruso Mikhail Tswett invento CL para separar varios pigmentos de  plantas. El inyecto el extracto de una planta y éter de petróleo a través de una columna de vidrio lleno de carbonato de calcio. Dado que esto fue hecho en una columna de vidrio, fue capaz de observar los cambios dentro de la columna. Al principio, sólo vio una capa de pigmento en la parte superior de la columna (figura 1.a). Pero a medida que pasa el tiempo, el pigmento se divide en cuatro capas de colores diferentes (Figura 1.b). La investigación descubrió más tarde que las cuatro capas eran  (i) de color verde azulado, clorofila a, (ii) de color verde amarillento, clorofila b, (iii) de color amarillo, xantina, y (iv) de color naranja; caroteno.
Todo el proceso de separación duró varias horas y por lo tanto no era un método muy práctico. Este tiempo largo de análisis fue una de las razones que la CL no se convirtió en una herramienta analítica popular hasta 1970, medio siglo después de la invención de Mikhail Tswett.

A continuación se presenta algunos de los términos utilizados en el análisis de cromatografía.
La cromatografía es una técnica de separación y la palabra cromatografía se originó de la palabra chroma  que significa “color” y graphein que significa “escribir”. Cromatógrafo es el equipo de separación y cromatograma es el gráfico obtenido en el análisis.

 

Técnica Analítica
No Imagen!

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Cromatografía

Cromatografo

Cromatograma

Figure 2. Imágenes de cromatografía, chromatografo, and cromatograma.

3. ¿Qué es el HPLC?
HPLC significa cromatografía líquida de alto rendimiento. Antes que el HPLC esté disponible, el análisis de LC era llevado a cabo por el flujo gravitacional del eluyente (el disolvente utilizado para el análisis de CL), lo que requiere varias horas para que el análisis sea completado. Incluso las mejoras añadidas más tarde fueron capaces solo de acortar el tiempo de análisis un poco. Los sistemas CL iniciales se llaman “cromatografía de baja presión” o “cromatografía en columna”.

En 1970 en los EE.UU., Jim Waters fundó Waters Corporación y comenzó a vender instrumentos de HPLC. Esto promovió el uso de HPLC en las áreas de análisis prácticos. Los sistemas de CL que Waters Corporation desarrolló utilizan bomba de alta presión que genera un rápido flujo de eluyente, y por lo tanto resultó en una mejoría dramática en el tiempo de análisis. Comparados con la “cromatografía de baja presión” los nuevos tipos se llamaron “cromatografía líquida de alta presión”. Por lo tanto, se solía pensar que HPLC significa cromatografía líquida de alta presión, sin embargo hoy en día es entendido que las siglas HPLC se refieren a Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento. Otro gran cambio a partir de la fecha de Tswett fue los métodos de adquisición de datos. En lugar de observar los cambios de las capas con los ojos, se acopló el sistema detector y la información de datos fueron grabados en hojas de papel. Si tuviéramos que demostrar el resultado del análisis de Tswett sería un gráfico (cromatograma), como la figura 3.

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  1. Naranja
  2. Amarillo
  3. Amarillento
  4. Verde Azulado

Figure 3. Representación del análisis LC de Tswett

 

Inicialmente, el Sistema HPLC se le refería como Waters Corporation’s System. Aun Ahora, Waters Corporation es el pionero de HPLC, pero hay  varias otras empresas que fabrican y venden sistemas de HPLC.
Técnicamente Hablando, la Palabra CL representa toda la cromatografía de Líquidos, incluyendo CL de baja presión, sin embargo, la mayoría de los sistemas de CL utilizada en estos días son HPLC lo que a menudo la palabra LC es utilizada para referirse al HPLC.

4. Los Componentes de HPLC
Típicamente el sistema HPLC consta de lo siguiente (Figura 4).
Los detalles de cada uno se explican abajo.

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Figure 4.

 

4.1  Bomba
En la primera etapa del desarrollo del HPLC, la bomba fue la parte más importante del sistema. El desarrollo del HPLC se puede decir que fue dado por el desarrollo del sistema de bombeo. La bomba se colocaba en lo más alto del sistema CL y generaba un flujo del reservorio del disolvente al sistema. En esta etapa el requisito más importante del sistema era poder generar una alta presión. Sin embargo, hoy en día, la generación de alta presión es normal y lo que más preocupa más hoy en día es proporcionar una presión constante en cualquier condición, para proporcionar un caudal controlable y reproducible dado que el cambio en la proporción del flujo puede influir el análisis en gran medida.
La mayoría de las bombas utilizadas en los sistemas LC actuales generan el flujo con un movimiento de vaivén de un pistón de motor (bombas de pistón). Debido a este movimiento del pistón, se produce “pulsos”. Ha habido grandes mejoras del sistema para reducir esta pulsación y las bombas recientes crean un pulso muy inferior a las antiguas bombas. Sin embargo, los análisis actuales requieren una sensibilidad muy alta para cuantificar una pequeña cantidad de analitos, e incluso un pequeño cambio en la velocidad del flujo puede influir en el análisis. Por lo tanto, las bombas necesarias para el análisis de alta sensibilidad tienen que ser muy precisas.

4.2 Inyector
Un inyector se coloca al lado de la bomba. El método más simple es utilizar una jeringa, y la muestra se introduce en el flujo de eluyente. Ya que la precisión de la medición por CL tiene mucho que ver con la reproducibilidad de la inyección de la muestra, el diseño de los inyectores es un factor importante. El método de inyección más utilizado se basa en lazos de muestreo. El uso de muestreador automático (auto-inyector) del sistema también es ampliamente utilizado ya  que permite una serie de inyecciones repetitivas en un tiempo programado.

4.3 Columna
La separación se lleva a cabo dentro de la columna, por lo tanto, se puede decir que la columna es el corazón de un sistema de  CL. La teoría de la cromatografía en columna no ha cambiado desde la época de Tswett, sin embargo ha habido una continua mejora en el desarrollo de la columna. Las columnas recientes suelen estar preparados en una carcasa de acero inoxidable, en lugar de columnas de vidrio utilizadas en el experimento de Tswett. En general, el material de relleno que se utiliza es de gel de sílice o de polímeros en comparación con el carbonato de calcio utilizado por Tswett.
El eluyente utilizado para la CL varía de ácido a solventes básicos. La mayoría de la cubierta de la   columna es de acero inoxidable y es tolerante a una gran variedad de disolventes. Sin embargo, para el análisis de algunos analitos como las biomoléculas y los compuestos iónicos, el contacto con el metal no es deseable, por lo tanto columnas con cubierta de poliéter éter cetona (PEEK) se utiliza en su lugar.

 

4.4 Detector
La separación de los analitos se realiza dentro de la columna, mientras que un detector se utiliza para observar la separación obtenida.  La composición del eluyente es consistente cuando no hay analito está presente, en cambio la presencia del analito cambia la composición del eluyente. Lo que el detector hace es medir estas diferencias. Esta diferencia se observa como una forma de señal electrónica. Hay diferentes tipos de detectores disponibles. Diferentes tipos detector y se explican en la lección 6.

4.5 Registración de Datos
El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de señal electrónica, y así no es visibles a nuestros ojos. En otros tiempos,  la pluma- papel-registrador gráfico se utilizaba muy popularmente. Hoy en día, una computadora con un posesor de base de datos (integrador) es más común. Hay varios tipos de procesadores de datos, e incluye un sistema simple que consiste en construir la impresora y el procesador de textos, y un tipo de computadora personal que consta de monitor, teclado e impresora. También hay programas que están diseñados específicamente para el sistema LC. Ofrece no sólo la adquisición de datos,  pero también cateréticas como máximo de ajuste, la corrección de línea base, el cálculo automático de la concentración, la determinación del peso molecular, etc
Los componentes introducidos hasta el momento son los fundamentos del sistema LC. A continuación se presentan algunos equipos opcionales se utiliza con el sistema básico de LC.

4.6 Desgasificador
El eluyente utilizado para análisis con LC puede contener gases como oxígeno que son no visibles a nuestros ojos. Cuando el gas está presente en eluyente, este se detecta como un ruido y causas una línea base inestable. Generalmente los métodos que se utilizan incluye el burbujeo (burbujeo de gas inerte), uso de bomba de vacio, sistema destilación, y / o calentamiento y agitación. Sin embargo, estos métodos no son convenientes cuando el disolvente se deja por un período de tiempo determinado (por ejemplo, durante un análisis largo). El desgasificador usa unos tubos de membrana de polímero especial para eliminar los gases. Los numerosos pequeños poros en la superficie del tubo de polímero permite que el aire pase a través mientras que previene cualquier otro líquido pasar a través del poro. Mediante la colocación de esta tubería bajo el contenedor de baja presión, crea las diferencias de presión dentro y fuera de la tubería (mayor en el interior del tubo). Esta diferencia  hace que el gas disuelto se mueva a través de los poros y eliminar el gas. En comparación con el tipo clásico de desgasificación por lotes, el desgasificador se puede utilizar on-line, es más conveniente y eficiente. Muchos de los nuevos sistemas HPLC contienen un desgasificador.

4.7 Horno de columna
La separación con LC es a menudo muy influenciada por la temperatura de la columna. Con el fin de obtener resultados repetibles, es importante mantener una temperatura constante. También para algunos análisis, como el azúcar y los ácidos orgánicos,  se puede obtener mejor resolución a temperatura elevada (50 ~ 80 º C). También es importante mantener una temperatura estable para obtener resultados repetibles, incluso cuando se analiza a una temperatura de ambiente. Hay posibilidades de que los diferentes cambios de temperatura haga que los resultados de la separación sean diferentes. Generalmente las columnas se mantienen dentro del horno de columna (calentador columna).

5  Otro tipos de Cromatografía
Otro miembro de la cromatografía, que se utiliza a menudo como el LC, es la cromatografía a gas (GC). Mientras LC utiliza eluyente (flujo generado por un sistema de bombeo), GC utiliza el gas (gas portador), siempre desde un tanque de gas, por lo que no requiere sistema de bombeo. Por lo tanto, el sistema de GC es más simple que el sistema LC y por esa razón, era ampliamente disponible antes de que el sistema LC llegara a ser popular. En ese momento, palabra cromatografía se refiere al GC. La sencillez del  sistema GC es una ventaja pero también una desventaja. Las muestras que se analizaron tienen que estar en forma gaseosa antes de ser introducido en el flujo del gas portador. Por lo tanto, si la muestra original esta en forma gaseosa, el GC es una herramienta conveniente.  Sin embargo, la mayoría de las muestras son en forma líquida o sólida y requiere calentamiento a alta temperatura para convertirlo en gas. Algunos analitos se alternan por el calor, por lo que el método de GC no es ideal para ese caso. Problema relacionado es que GC tiene un límite superior para el análisis de compuestos de gran peso molecular.
En comparación, las muestras líquidas pueden ser analizadas directamente por LC. Además, si la muestra sólida puede ser disuelta en un solvente, esta puede ser analizada por LC. Algunas muestras son insolubles en agua, pero la mayoría de ellos son solubles en disolventes orgánicos, hay una alta probabilidad de que podemos encontrar un solvente que disuelve la muestra. Por lo tanto, LC se puede utilizar a temperatura de ambiente (es decir, sin causar alteración de la sustancia analizada) para una amplia gama de análisis. Esto hizo que el método de LC pueda ser más popular que el método de GC. Hay otros tipos de cromatografía como la cromatografía en capa fina, super-crítica cromatografía de fluidos, papel, etc, pero sus usos son aún menos populares que el GC.

 

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